단백다당체 고생산성의 Inonotus obliquus 균주의 신속 개량을 위한 고체 성장배지의 통계적 최적화

초록

광범위한 약리작용을 가지고 있어 질병의 치료 및 예방에 효과가 있는 천연물 중 가장 주목받고 있는 약용버섯은분류학상 균류 (Fungi) 중 진균류 (Eumycetes)에 속하며대부분은 담자균류 (Basidiomycetes)의 일종이다 [1,2]. 최근담자균류 유래 약용버섯들의 항암효과가 과학적으로 입증되고 있으며 [3,4], 약용버섯 추출물 중에서 특별히 면역증강작용에 의해 탁월한 항암효능과 당뇨병 개선효과를 보이는 생리활성물질은 β-D-glucan 구조를 갖는 수용성 단백다당체 (향후 “단백다당체”로 명명함)로 구성되어 있음이 밝혀졌다 [5,6,7,8]. 표고버 섯균사체 추출물의 경우 면역증강효과로 인해 기능성 식품과 암치료 (보조)제 의약품으로사용되고 있다. 이 버섯의 자실체에서 추출한 단백다당체역시 항암성 면역증강제인 Lentinan 주사제로 판매되고 있다. 이 외에도 액상배양된 운지버섯 균사체에서 추출한 단백다당체 (PSK 및 Krestin)는 항암성 면역증강제로, 치마버섯균사체 배양시 생합성되는 세포외다당체 (exopolysaccharides)역시 동일한 효능의 주사제 (Shizophyllan)로 판매되고 있다. 학명이 Inonotus obliquus로 불리는 차가 (Chaga, Tchaga)버섯은, 나무줄기나 그루터기에 자생하는 백색부후균의 일종으로, 1년에 0.9 cm 이하로 자라는 매우 귀한 약용버섯이다. Inonotus obliquus 유래의 대표적인 생리활성물질인 단백다당체의 경우 항당뇨 효과 [9] 및 면역증강 효과로 인한 항암효과가 뛰어난 것으로 이미 오래 전에 입증된 바 있는데[10,11,12], 이러한 단백다당체는 특별히 고안된 정제과정을거쳐 정제될 경우 건조중량의 5% 이하의 함량을 나타내는미량성분이다 [13,14]. Inonotus obliquus는 최소 5년 이상성장해야 포자가 형성되고, 통상 10~20년 이상 자라야 채집이 가능한 것으로 알려져 있다. 이처럼 차가버섯 자실체의까다로운 성장조건으로 인해 생산성이 매우 낮으므로, 정품의 야생 차가버섯을 구입하기가 쉽지 않고, 그 가격 또한 매우 비싼 실정이다. 한편 차가버섯 자실체의 고체배양에 의해단백다당체를 생산하는 방법은 대량생산 시 품질관리가 힘들며 자실체 재배를 위한 많은 노동력과 시간이 요구됨에따라 생산성도 떨어지는 단점이 있다 [15,16]. 반면에 차가버섯 균사체 액상배양을 통한 단백다당체생산공정은 기존의 자실체 배양을 통해 생산하는 방법에 비해 보다 잘 규명된 조건하에서 대량 생산이 가능하며 배양기간 또한 단축시켜 생산성을 크게 높일 수 있는 장점이있다 [17,18,19]. Inonotus obliquus 균사체의 액상배양에의한 단백다당체의 산업적인 대량생산을 위해서는 고생산성균주의 확보가 핵심적인 관건이다. 고생산성 균주를 개발하기 위해서는 최종 생산배양에서 선별된 균주들의 단백다당체 생산성을 확인해야 하는데, 이를 위해서는 다음의 일련의 배양공정을 거쳐야 한다: 단일 콜로니를 얻기 위한 원형질체 형성 및 재생, 고체성장배지에서의 계대배양 (고체성장배장), 정치배양, 플라스크에서의 액상 성장배양을 거쳐최종적으로 플라스크 또는 발효조애서의 액상 생산배양. 이일련의 배양공정에서 균주개발 시 가장 큰 장애요인은 고체성장배지에서의 계대배양 (이후 “고체성장배양”)인데. 그이유는 이 배양 단계에서 특별히 장기간의 배양 시간이 요구되어 신속한 균주개발이 매우 어렵기 때문이다. 본 연구에서는 고체성장배양 시의 이러한 문제점을 극복하고자, 배양환경의 최적화에 대한 연구를 중점적으로 수행하였다. 본연구팀은 실제로 원형질체 형성을 통한 균주 개량에 관한연구를 통해, 고체성장배양에서 훌륭한 성장 특성을 보이는 균주들이 최종 액상 생산배양에서도 단백다당체의 생산성이 높음을 확인한 바 있다 [20]. Inonotus obliquus 균사체와 같은 균사형성 고등균류의경우 배지성분에 따라 배양 생리적 및 배양 형태적 특성이확연히 달라진다. 따라서 고생산성 균주의 신속 선별을 위해서는 고체성장배지에 포함되는 영양원의 성분 및 조성의최적화가 필수적이다. 배지 최적화를 수행할 때 단일 요소에 대해서만 변화를 줄 경우, 영양원 간의 상호작용을 제대로 파악할 수 없으므로 최적 배지조성을 찾기 힘들며,여러 요소를 전체적으로 조사할 경우 과다한 실험양으로인한 한계에 직면하게 된다. 이러한 어려움을 해결하기 위해 본 연구에서는 유용대사산물의 생물공학적 대량생산을위해 주로 사용되는 통계적 배지최적화 방법을 도입하였다[21,22,23]. 즉 고체성장배지의 조성을 최적화하기 위해 균체의 성장속도에 큰 영향을 미치는 주요 배지성분들을 우선 찾아내고, 그 성분들의 교호작용을 확인하기 위한 다양한 통계적 실험방법들을 순차적으로 적용한 후, 최종적으로 반응표면분석법을 적용하여 균사체의 성장속도가 최대가 되는 배지조성을 결정하였다.

키워드