파파인을 이용한 피브로인 펩타이드의 글리세릴 에스터화 반응

초록

양잠누에 (Bombyx mori)의 고치에서 생산되는 섬유 단백질인 피브로인은 대부분의 단백질과 달리 크기가 작은 아미노산인 글리신 (glycine) 알라닌 (alanine) 세린 (serine)의 조성비가 각각 48, 32 및 11%로 전체의 91%를 차지하며 [1],글리신과 알라닌, 세린 및 타이로신 (tyrosine)이 교대로 치환된 Gly-X (X: Ala 65%, Ser 23%, Tyr 9%)가 반복되는아미노산 서열 구조를 가지고 있다 [2]. Jeong 등 [3]은 이와같이 아미노산 서열이 반복되는 특성을 이용하여 피브로인을파파인으로 가수분해하여 [Gly - X]n - (n = 2, 4, 6 및 8)인짝수의 올리고 펩타이드가 대부분인 가수분해물을 얻을 수있다고 보고하였다. 다른 단백질의 가수분해물의 펩타이드조성은 매우 다양한 반면, 피브로인 가수분해물은 매우 제한적인 종류의 짝수 펩타이드로 주로 구성되어 있고 산업적인 수준으로 대량 얻을 수 있어 다양한 정밀화학제품의 원료로 활용할 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어 펩타이드와글리세리드 (glyceride)가 결합한 1-peptidyl-2-arachidonoyl-3-stearoyl-sn-glyceride는 양의 혈청에서 발견되는 면역활성물질이다 [4]. 이와 같이 지방산의 종류나 펩타이드의 종류를달리하여 다양한 펩타이드 글리세리드를 합성할 수 있고,이들 중에는 특별한 생리활성을 가지는 펩타이드 글리세리드가 있을 수 있으나, 아직까지 이와 같은 다양한 펩타이드 글리세리드를 합성한 보고는 없다. 현재까지는 펩타이드 대신아미노산 글리세리드가 새로운 바이오 계면활성제로서 개발할 목적으로 효소적인 방법으로 합성된 바 있다 [5]. 펩타이드 혼합물을 효소적으로 가공하여 기능을 개선시키는 방법은알려져 있으나, 이 과정에서 각각의 펩타이드의 조성의 변화를 질랑분석기를 이용하여 추적한 결과는 보고된 바 없다. 그리고 혼합물의 특성상 여러 종류의 기질이 단일 효소와반응하는 경우, 효소 반응의 특성, 기질특이성에 따른 펩타이드 혼합물의 조성의 변화 및 이 과정에서 효소의 기질특이성을 역추적할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 피브로인 펩타이드를 효소적으로 수식하여 펩타이드 글리세리드를 합성하는 중간단계로 파파인을 이용하여 글리세롤 에스터화 반응을 통하여 피브로인 펩타이드의 글리세릴 에스터를 합성하는 반응을 수행하였다. 특히 파파인은 펩타이드 가수분해 활성뿐만 아니라 에스터분해효소 (esterase)의 활성을 동시에 가지고 있으므로 [6],효소적으로 에스터를 합성하는데 사용되어 왔다. 그동안 파파인은 유기용매가 첨가된 조건하에서 주로 아미노산인 알라닌을 알코올류를 에스터 결합시키거나 [7], 펩타이드에 에탄올을 에스터 결합시키거나 [8] 혹은 D, L 아미노산의 분활하는데 [9] 사용되었다. 이후 Mintin 등 [10]은 파파인으로 N 말단이 보호된 여러 종류의 아미노산에 글리세롤을 에스터결합시키는 반응을 성공하였다. 효소적 에스터화 반응의 촉매로 빈번하게 사용되는 트립신과 달리 파파인은 넓은 기질특이성 [11]을 가지고 있으므로 다양한 기질에 글리세릴 에스터를 형성할 수 있을 것으로 예상된다. 따라서 본 연구에서는, 파파인으로 가수분해된 피브로인펩타이드에 추가적으로 글리세롤을 공급하고 반응조건을변화시켜 피브로인 펩타이드에 글리세릴 에스터 결합을형성시키는 역반응을 시도하였다. 에스터 결합을 형성하기위해서는 카복실기가 해리되지 않은 상태에서 -COOH의OH기가 효소의 활성부위의 아미노산의 잔기와 수소결합을 형성한 후 분리되어야 하므로, 에스터화 반응은 펩타이드의 카복실기의 pKa 값보다 충분히 낮은 pH 3에서 과량의 글리세롤을 첨가하여 반응시키고 각각의 펩타이드의글리세릴 에스터의 생성 여부는 전기분무 이온화형 질량분석기 (ESI-MS)를 이용하여 분석하였다. 아울러 생성된 글리세릴 에스터는 카복시 말단이 에스터화되어 중성용액에서양전하를 띠는 점을 활용하여 이온교환수지 칼럼을 이용하여 회수하였다.

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